适用于新鲜或冷冻的血清、血浆、淋巴液、尿液等无细胞体液，以及使用游离DNA保存管或尿液样本保存管保存的样本。

将蛋白酶K粉末用蛋白酶K保存液溶解，使其终浓度为20 mg/mL。配制后需-20℃保存，避免反复冻融。

如有结晶或者沉淀，请将该缓冲液于56℃水浴孵育重新溶解。

不可以。

1. 样本相关问题

· 原因: 样本质量差、反复冻融、或起始样本中游离DNA含量过低。

· 解决方案:

o 尽量使用新鲜采集或妥善保存（避免反复冻融）的样本。

o 确保样本类型符合说明书要求（血清、血浆、尿液等）。

o 如果样本量允许，可适当增加起始样本体积（最多5 mL血浆/4 mL尿液），并按比例增加蛋白酶K、稀释缓冲液和结合缓冲液的用量。

2. 试剂配制与预处理问题

· 原因:

o 首次使用时未向浓缩缓冲液中加入乙醇或异丙醇。

o 配制好的蛋白酶K活性降低。

o 缓冲液有结晶或沉淀未完全溶解。

· 解决方案:

o 首次使用前，务必严格按照试剂瓶标签说明，向结合缓冲液（浓缩液）中加入异丙醇，向漂洗缓冲液1和2（浓缩液）中加入无水乙醇，并混合均匀。

o 配制好的蛋白酶K应分装保存于-20℃，避免反复冻融导致失活。

o 使用前检查缓冲液，如有结晶或沉淀，需在56℃水浴中加热至重新溶解。

3. 操作流程问题

· 原因:

o 孵育时间或温度不足，导致细胞裂解和蛋白消化不彻底。

o 结合或洗涤步骤中混合不充分。

o 负压过高或抽吸过快，导致结合效率下降。

o 乙醇残留影响后续洗脱效率。

· 解决方案:

o 确保裂解孵育步骤在60℃下进行30分钟，期间需颠倒混匀数次以确保充分裂解。

o 加入结合缓冲液后，应剧烈震荡或充分颠倒混匀，形成均一的混合溶液。

o 使用负压装置时，应缓慢抽吸，过快过强的负压会降低DNA与膜的结合效率。

o 在加入洗脱液之前，将吸附柱在室温静置数分钟，确保残余乙醇完全挥发。

4. 洗脱问题

· 原因:

o 洗脱体积过小。

o 洗脱液未加至吸附膜中央。

o 洗脱时间不足。

· 解决方案:

o 根据所需DNA浓度，适当增加洗脱缓冲液体积（可在20-150 μL范围内调整）。

o 确保将洗脱缓冲液滴加在吸附柱膜的中央部位。

o 加入洗脱缓冲液后，室温静置至少3分钟，让洗脱缓冲液充分浸润膜。

o 可将洗脱液预热至60℃后再使用，并进行二次洗脱。

DNA纯度低通常表明提取的DNA中含有杂质，如蛋白质、盐离子或有机溶剂（乙醇）。其A260/A280比值理想值约为1.8。

· 比值偏低 (<1.8)：通常表示有蛋白质残留。

· 比值偏高 (>2.0)：通常表示有RNA残留或胍盐等化学试剂残留。

1. 残留蛋白质污染 (导致A260/A280偏低)

· 原因:

o 蛋白酶K消化不完全或失效。

o 样本量过多，蛋白酶K不足以完全消化所有蛋白质。

o 裂解孵育时间或温度不足。

· 解决方案:

o 确保配制好的蛋白酶K分装保存于-20℃，避免反复冻融导致失活。

o 检查样本量是否在试剂盒规定范围内（血浆≤5 mL，尿液≤4 mL）。如果样本量很大，请按比例增加蛋白酶K的用量。

o 严格保证裂解步骤在60℃孵育30分钟，并可在此期间涡旋振荡数次，以充分裂解和消化。

2. 乙醇残留 (导致A260/A280比值异常并抑制下游实验)

· 原因:

o 洗涤后吸附柱干燥不彻底

· 解决方案:

o 在加入洗脱液之前，将吸附柱在室温静置数分钟，确保残余乙醇完全挥发。

3. 盐离子残留 (导致A260/A230偏低)

· 原因:

o 漂洗缓冲液中的乙醇未正确添加。

· 解决方案:

o 首次使用前，务必确认已向漂洗缓冲液1和2（浓缩液）中加入了指定体积的无水乙醇，并充分混匀。