Endofree Plasmid Mega Kit（Resin）

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Endofree Plasmid Mega Kit（Resin）

无内毒素质粒超量提纯试剂盒（树脂法）

¥4408.00

货号： CW2115M

规格：

5 preps

数量： - + [ 现货 ]

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产品介绍
产品参数
产品说明书
FAQs

本试剂盒是基于高特异性结合质粒 DNA 的独特树脂微球设计的一款质粒纯化产品，可满足高产量与高纯度的超螺旋质粒纯化需求。阴离子交换树脂微球填充的预装层析柱（COWIN-tip 2500），可从 500 mL 的 LB 菌液中纯化制备2.5 mg 转染级质粒 DNA, 适用于包括转染（原代、敏感以及悬浮细胞）、显微注射和基因治疗等多种研究。

▪ COWIN-tip 2500 预装层析柱的质粒载量高达 3 mg。

▪ 本产品制备的转染级质粒内毒素含量 < 0.05 EU/μg。

▪ 通过重力流方式，可在 2.5 小时内完成高纯度转染级质粒的制备。

▪ 适用于提取纯化 3-50 kb 大小的不同拷贝数质粒。

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RT（15-30℃）	室温

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Q1：低拷贝质粒该如何提取？

A1：

若所提质粒拷贝数较低，可加大菌体使用量，同时按照比例增加Buffer RES、Buffer LYS、Buffer NEU的用量保证菌体可以被完全裂解，洗脱缓冲液Buffer ELU应在65℃水浴锅预热，同时在吸附和洗脱时可以适当地延长时间，以增加提取效率。若试剂盒中RES、LYS和NEU溶液不能满足实际用使用量是，客户可直接购买本公司的成品溶液和抽滤杯（COWIN-filter Mega Cartridge）。

Q2：DNA 产量低的原因及解决办法？

A2：

（1）质粒拷贝数：载体因拷贝数差异会造成质粒产量明显的波动。高拷贝数的载体常有2-3倍的产量波动，(每毫升培养过夜的菌液，高拷贝数的质粒载体产量为3-16 μg)。长片段质粒和表达型载体常以中低拷贝数为主，每毫升菌液的产量约为0.5~2 μg。

◇低拷贝质粒：pBR322, pACYC 及其衍生载体，pSC101 及其衍生载体，SuperCos, pWE15；

◇高拷贝质粒：pTZ, pUC, pBS, pGM-T；

（2）菌种问题：菌种保存过程中存在质粒丢失现象，培养细菌前最好先划线活化，以稳定产量。

（3）细菌未充分裂解：细菌须在Buffer RES/RNase A 中充分重悬，成团的细菌因无法裂解会降低产量。

（4）试剂准备有误：Buffer LYS、Buffer NEU有沉淀析出，需37℃水浴几分钟至清亮方可使用（请勿剧烈晃动Buffer LYS）；Endo-Free Buffer PW1加入乙醇体积不准确(使用前应按照试剂瓶标签的说明在Endo-Free Buffer PW1中加入无水乙醇)。

（5）实验操作不当：在异丙醇沉淀步骤中，由于形成的玻璃状DNA沉淀往往不易观察且松散附着于管壁，极易在后续操作中丢失。建议实验人员严格遵循本产品的《产品说明书》的标准流程进行实验操作。

（5）将Buffer ELU预热至65℃，并重复二次洗脱。

（6）培养时间过长或在 2-8℃保存时间过长会明显降低产量，建议使用新鲜的菌液。

（7）对于难处理的DNA沉淀，可尝试降低离心速度或改用预冷70%乙醇进行轻柔洗涤等优化措施。

Q3：Buffer LYS和Buffer NEU有沉淀怎么办？

A3：

37℃水浴混匀至澄清后使用，请勿剧烈晃动Buffer LYS。

Q4：质粒 DNA 中有基因组 DNA 污染该如何解决？

A4：

加入Buffer LYS后应温和混匀，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA。此步骤所用时间应不超过5分钟，避免质粒受到破坏。

Q5：RNase A未加入Buffer RES会怎样？

A5：

导致RNA污染，需补加RNase A至Buffer RES（终浓度200 μg/mL），混匀后2-8℃保存。

Q6：提取的质粒DNA下游实验结果不佳的原因？

A6：

乙醇残留。Endotoxin-free Buffer PW1 洗涤后可延长干燥时间，待质粒DNA沉淀表面乙醇挥发完全后再加入Buffer TE-EF或Endotoxin-free H₂O。

Q7：CW2115M 可以用来提取酵母质粒吗（将质粒转化到酵母感受态）？

A7：

不可以，因为酵母是真菌，细胞壁比大肠杆菌（细菌）的更厚，因此使用CW2115M更难裂解，建议使用Yeast Plasmid Mini Kit（CW0509S ）提取。

Q8：试剂盒里面的 RNase A 和 Buffer RES 混合后，说明书建议 2-8℃存放，放到室温2 天还可以用吗？

A8：

可以。最好按照标准存放。

Q9：若产物发现RNA残留？

A9：

（1）储存温度不当或超出有效期：已加入RNase A的Buffer RES长时间室温放置可能会出现酶活下降，使用后应及时放回2 ~ 8℃。

（2）菌液体积过高：由于菌体数量过多，导致Buffer RES中RNase A不足以消化菌体中的RNA，建议减少菌液体积进行实验。

Q10：能否使用Endofree Plasmid Mega Kit (Resin) 提取的DNA进行转染实验？

A10：

可以，该试剂盒提取的质粒纯度满足测序、PCR、酶切和转染等需求。

Q11：使用CW2114M质粒试剂盒时DNA沉淀过度干燥怎么办？

A11：

通过轻微加热溶液（例如37℃孵育）并延长溶解时间来重新溶解DNA。

Q12：使用Endofree Plasmid Mega Kit (Resin)时，为什么在琼脂糖凝胶上观察到质粒条带上方有拖尾现象？

A12：

在质粒条带上方出现的拖尾现象可能表明质粒提取物中存在基因组DNA污染。虽然这种情况并不常见，但基因组DNA可能在裂解过程中被剪切并与质粒共同纯化。加入Buffer LYS后剧烈摇晃或涡旋可能会产生断裂的基因组DNA，应避免这种情况。如果裂解液非常粘稠且混合不均匀，建议减少实验使用的细胞起始量。

Q13：使用Endofree Plasmid Mega Kit (Resin)进行质粒提取后，哪些因素会影响提取产物的A260/280比值？

A13：

A260/280比值通过比较核酸最大吸收峰260nm与蛋白质最大吸收峰280nm的吸光度值，可评估所洗脱DNA的相对纯度。若中和反应不充分或洗涤步骤不完全，可能导致过量蛋白质残留在基质中并与DNA共同洗脱。

Q14：使用Endofree Plasmid Mega Kit (Resin)进行质粒提取后，哪些因素会影响提取产物的A260/230比值？

A14：

培养基成分和某些细胞成分会降低A260/A230比值。按照实验方案操作可确保去除这些污染物。此外，某些颗粒物可能与DNA一起洗脱，从而影响该比值。若出现这种情况，可在分光光度计（如Nanodrop^®）检测前对洗脱的DNA进行额外15秒离心以沉淀颗粒物。

Q15：Endofree Plasmid Mega Kit (Resin) 能否保证回收无内毒素的质粒DNA？

A15：

虽然Buffer ETR能去除样品中绝大部分内毒素，但无法保证回收的DNA完全不含内毒素。需要说明的是，我们已成功使用该试剂盒回收的质粒DNA转染多种耐受性强的细胞系。尽管其他供应商可能宣称其小提试剂盒"无内毒素"，但通常仍可检测到微量内毒素存在。

Q16：必须自备哪些设备？

A16：

负压抽滤装置（含收集瓶）、离心机、无热原耗材（吸头、离心管等）。

Q17：如何保持离心管无内毒素污染？

A17：

为确保实验材料无内毒素污染，建议遵循以下操作规范：首选经认证的无热原/内毒素一次性塑料耗材（市售多种品牌可选），避免使用玻璃器皿—因其表面易吸附内毒素且常规清洗和高压灭菌均无法有效清除（若必须使用玻璃器皿，需180℃干热过夜处理）。特别注意曾接触细菌的灭菌锅会造成玻璃器皿二次污染。

Q18：使用Cartridges时，如何预防柱体堵塞？

A18：

关键确保菌液与Buffer RES/LYS充分混合裂解。不完全混合会导致裂解液粘稠，进而堵塞滤膜基质。建议：（1）加入Buffer RES后完全重悬细胞；（2）加入Buffer LYS后充分混匀；（3）Buffer NEU加入后充分混合使细胞碎片形成白色沉淀上浮。若白色沉淀未上浮，可用无菌枪头将其从管壁剥离，否则会积聚在滤膜上导致堵塞。使用CWBlue试剂可确保获得最佳混合效果。

Q19：Buffer EQU的作用是什么？

A19：

Buffer EQU是平衡液，其中的表面活性剂降低了溶液表面张力，使得COWIN-TIP 500柱中的溶液易于形成重力流，进而便于完全排尽柱中溶液。

Q20：是否需要离心机？

A20：

主要步骤依赖重力流层析（无需离心机），但菌液收集和质粒浓缩时需离心（≥15,000×g）。

Q21：CWBlue-A指示剂是否必须使用？

A21：

非必需，但建议添加以便监控裂解（变蓝色）和中和（无色+白色沉淀）效果。