离心后溶液不分层，主要可能由以下原因导致：

1. 混合不充分：加入氯仿后，需剧烈振荡至少15秒，以确保充分混合，此为分相的关键前提。

2. 氯仿比例错误：请务必确认氯仿添加量准确无误。标准比例为每使用1 mL TRIzon试剂需加入0.2 mL氯仿。

3. 样品过载或过于粘稠：当处理蛋白、多糖或脂肪含量高的特殊样本时，裂解液会异常粘稠，阻碍分相。可在加入氯仿前，先将匀浆液于 4℃、12,000 rpm 离心10分钟，弃除沉淀，取上清进行后续操作。

若已发生不分层情况，可尝试以下补救措施：

1. 再次混合与离心：在确认氯仿已按比例添加的前提下，将反应液再次剧烈振荡，并于 4℃、12,000 rpm 条件下重新离心。

2. 追加氯仿：若高度怀疑氯仿添加量不足，可谨慎地补加少量氯仿，随后充分振荡并离心。