EndoFree Plasmid Midi Kit
无内毒素质粒中提试剂盒(5-15mL)
¥298.00
CW2105S
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本产品采用独特的硅基质膜吸附技术，在碱裂解法裂解细胞的基础上，高效专一的结合质粒DNA。每次可处理5-15 mL菌液，获得多至100 μg转染级质粒DNA。使用特殊的去内毒素buffer ER，有效的去除内毒素、蛋白质等杂质。产品内另配备特殊指示剂CWBlue，保障质粒提取高效完成。
▪ 操作准确：加入颜色指示剂，保证操作的准确性，得到纯度高、质量稳定的质粒。
▪ 提取得率高：适用于5-15mL菌液，质粒得率可多至100μg，提高实验效率。
▪ 无内毒素：采用特殊的缓冲液系统和去内毒素Buffer，可获得转染级质粒。
▪ 适用范围广：适用于各种大小和高低拷贝数的目的质粒。
1. 适用于高拷贝/低拷贝质粒提取
【实验一】使用康为世纪无内毒素质粒中提试剂盒(CW2105)分别取7.5mL/15mL菌液提取高拷贝（p13）及低拷贝（PEGX）质粒，结果如下：
图1： M: DM10000 LaneA、B: A品牌质粒中提试剂盒 ; LaneC、D: 康为世纪无内毒素质粒中提试剂盒(CW2105)
图2：M: DM10000 LaneA、B: A品牌质粒中提试剂盒 ; LaneC、D: 康为世纪无内毒素质粒中提试剂盒(CW2105)
实验结果表明：康为世纪无内毒素质粒中提试剂盒(CW2105)应用范围广，适用于高拷贝/低拷贝质粒提取，得到的质粒纯度高，完整性好。
| 保存条件 | 运输条件 |
|---|---|
| RT（15-30℃） | 常温 |
若所提质粒拷贝数较低或大于10 kb的大质粒，可加大菌体使用量，同时按照比例增加Buffer P1、Buffer P2、Buffer E3的用量保证菌体可以被完全裂解，洗脱缓冲液Endo-Free Buffer EB应在65℃-70 ℃水浴锅预热，同时在吸附和洗脱时可以适当地延长时间，以增加提取效率。
（1）质粒拷贝数：载体因拷贝数差异会造成质粒产量明显的波动。高拷贝数的载体常有2-3倍的产量波动，（每毫升培养过夜的菌液，高拷贝数的质粒载体产量为3-16 μg）。长片段质粒和表达型载体常以中低拷贝数为主，每毫升菌液的产量约为0.5~2 μg；
◇低拷贝质粒：pBR322, pACYC 及其衍生载体，pSC101 及其衍生载体，SuperCos, pWE15；
◇高拷贝质粒：pTZ, pUC, pBS, pGM-T；
（2）菌种问题：菌种保存过程中存在质粒丢失现象，培养细菌前最好先划线活化，以稳定产量；
（3） 细菌未充分裂解：细菌须在Buffer P1/RNase A 中充分重悬，成团的细菌因无法裂解会降低产量；
（4） 试剂准备有误：Buffer P2和Buffer E3有沉淀析出，需37℃水浴几分钟至清亮方可使用（请勿剧烈晃动Buffer P2）；Buffer PW加入乙醇体积不准确（使用前应按照试剂瓶标签的说明在Buffer PW中加入无水乙醇）；
（5）将Endo-Free Buffer EB预热至65℃-70 ℃，并重复二次洗脱；
（6）培养时间过长或在 2-8℃保存时间过长会明显降低产量，建议使用新鲜的菌液。
37℃水浴混匀至澄清后使用，请勿剧烈晃动Buffer P2。
加入Buffer P2后应温和混匀，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA。此
步骤所用时间应不超过5分钟，避免质粒受到破坏。
导致RNA污染，需补加RNase A至Buffer P1（终浓度200 μg/mL），混匀后2-8℃保存。
乙醇残留。Buffer PW 洗涤后应尽量离心去除残留的液体，待硅胶膜完全干燥后再加入洗脱缓冲液。
不可以，因为酵母是真菌，细胞壁比大肠杆菌（细菌）的更厚，因此使用CW2105S更难裂解，建议使用Yeast Plasmid Mini Kit（CW0509S ）提取。
可以。最好按照标准存放。
（1）储存温度不当或超出有效期：已加入RNase A的Buffer P1长时间室温放置可能会出现酶活下降，使用后应及时放回2 ~ 8℃。
（2）菌液体积过高：由于菌体数量过多，导致Buffer P1中RNase A不足以消化菌体中的RNA，建议减少菌液体积进行实验。
可以，该试剂盒提取的质粒纯度满足测序、PCR、酶切和转染等需求。
可以使用无菌无内毒素的核酸酶游离水（pH 7.0-8.5）从离心柱中洗脱DNA，以获得最佳洗脱效率。如需长期保存DNA，推荐使用试剂盒配套的DNA洗脱缓冲液。
在质粒条带上方出现的拖尾现象可能表明质粒提取物中存在基因组DNA污染。虽然这种情况并不常见，但基因组DNA可能在裂解过程中被剪切并与质粒共同纯化。加入Buffer P2后剧烈摇晃或涡旋可能会产生断裂的基因组DNA，应避免这种情况。如果裂解液非常粘稠且混合不均匀，建议减少实验使用的细胞起始量。
A260/280比值通过比较核酸最大吸收峰260nm与蛋白质最大吸收峰280nm的吸光度值，可评估所洗脱DNA的相对纯度。若中和反应不充分或洗涤步骤不完全，可能导致过量蛋白质残留在基质中并与DNA共同洗脱。
培养基成分和某些细胞成分会降低A260/A230比值。按照实验方案操作可确保去除这些污染物。此外，某些颗粒物可能与DNA一起洗脱，从而影响该比值。若出现这种情况，可在分光光度计（如Nanodrop®）检测前对洗脱的DNA进行额外15秒离心以沉淀颗粒物。
培养基成分和某些细胞成分会降低A260/A230比值。按照实验方案操作可确保去除这些污染物。此外，某些颗粒物可能与DNA一起洗脱，从而影响该比值。若出现这种情况，可在分光光度计（如Nanodrop®）检测前对洗脱的DNA进行额外15秒离心以沉淀颗粒物。
虽然Endo-Remover FM和Buffer ER能去除样品中绝大部分内毒素，但无法保证回收的DNA完全不含内毒素。需要说明的是，我们已成功使用该试剂盒回收的质粒DNA转染多种耐受性强的细胞系。尽管其他供应商可能宣称其小提试剂盒"无内毒素"，但通常仍可检测到微量内毒素存在。
为确保实验材料无内毒素污染，建议遵循以下操作规范：首选经认证的无热原/内毒素一次性塑料耗材（市售多种品牌可选），避免使用玻璃器皿—因其表面易吸附内毒素且常规清洗和高压灭菌均无法有效清除（若必须使用玻璃器皿，需180℃干热过夜处理）。特别注意曾接触细菌的灭菌锅会造成玻璃器皿二次污染。
可进行内毒素去除加强版的操作步骤。若Buffer ER出现沉淀，请于37℃加热至完全溶解并充分混匀后使用。加入ER缓冲液后需上下颠倒以确保充分混匀。
柱平衡是通过Buffer PS预处理吸附柱，目的是激活硅基质膜，提高其对质粒DNA的结合效率，从而提升最终产物的纯度和得率。
非必需，但建议添加以便监控裂解（变蓝色）和中和（无色+白色沉淀）效果。
