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GoldHi EndoFree Plasmid Maxi Kit (Plus)

金牌超量无内毒素质粒大提试剂盒(加强型)

¥668.00

CW2113M

10 preps

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本产品每次可处理100-300 mL菌液,所得质粒纯度高、得率高,可获得多至2 mg转染级质粒DNA。采用特殊的去内毒素buffer ER和Endo-Remover FQ,可有效的去除内毒素、 蛋白质等杂质。产品内另配备特殊指示剂CWBlue,保障质粒提取高效完成。


操作准确:加入颜色指示剂,保证操作的准确性,得到纯度高、质量稳定的质粒。

提取得率高:适用于100-300mL菌液,得率大于2mg。

无内毒素:采用除内毒素过滤器和去内毒素Buffer ER,高效去除内毒素,可获得转染级质粒。

适用范围广:适用于各种大小和高低拷贝数的目的质粒。


1. 适用于高拷贝/低拷贝质粒提取

【实验一】使用康为世纪无内毒素质粒大提试剂盒分别提取高拷贝(p13)及低拷贝(pET-26b)质粒,洗脱体积2mL,1%琼脂糖凝胶电泳检测,上样5μL,结果如下所示:

图1:高拷贝质粒(左图)及低拷贝质粒(右图)提取结果

实验结果表明:康为世纪无内毒素质粒大提试剂盒应用范围广,适用于高拷贝/低拷贝质粒提取。


2. 质粒得率更高

【实验二】使用康为世纪无内毒素质粒大提试剂盒与A/B品牌分别进行对比,结果如下:

M:DM10000 ; Lane1、2: 金牌超量无内毒素质粒大提试剂盒 (CW2113) ; Lane3、4: A品牌无内毒素质粒大提试剂盒

图2:使用康为世纪无内毒素质粒大提试剂盒(CW2113)和A品牌无内毒素质粒大提试剂盒提取结果。

M:DM10000 ; Lane1、2、3:B品牌无内毒素质粒大提试剂盒 ; Lane4、5、6:康为世纪无内毒素质粒大提试剂盒(CW2113)

图3:使用康为世纪无内毒素质粒大提试剂盒(CW2113)和B品牌无内毒素质粒大提试剂盒提取结果。

实验结果表明:使用康为世纪无内毒素质粒大提试剂盒提取质粒,得到的质粒得率更高。


3. 去除内毒素,转染更高效

【实验三】使用康为世纪无内毒素质粒大提试剂盒提取的质粒,转染293细胞和Hela细胞,结果如下:



图4:使用康为世纪无内毒素质粒大提试剂盒(CW2113)提取的质粒,转染293细胞(左图)和Hela细胞(右图)后效果图。

实验结果表明:使用康为世纪无内毒素质粒大提试剂盒(CW2113)提取质粒,去内毒素效果好,转染效率高。

保存条件 运输条件
RT(15-30℃) 室温
Q1:低拷贝质粒或大质粒(>10 kb)该如何提取?
A1:

若所提质粒拷贝数较低或大于10 kb的大质粒,可加大菌体使用量,同时按照比例增加Buffer P1Buffer P2Buffer E3的用量保证菌体可以被完全裂解,洗脱缓冲液Endo-Free Buffer EB应在65℃-70 ℃水浴锅预热,同时在吸附和洗脱时可以适当地延长时间,以增加提取效率。

Q2:DNA 产量低的原因及解决办法?
A2:

(1)质粒拷贝数:载体因拷贝数差异会造成质粒产量明显的波动。高拷贝数的载体常有2-3倍的产量波动,(每毫升培养过夜的菌液,高拷贝数的质粒载体产量为3-16 μg)。长片段质粒和表达型载体常以中低拷贝数为主,每毫升菌液的产量约为0.5~2 μg;

◇低拷贝质粒:pBR322, pACYC 及其衍生载体,pSC101 及其衍生载体,SuperCos, pWE15;

◇高拷贝质粒:pTZ, pUC, pBS, pGM-T;

(2)菌种问题:菌种保存过程中存在质粒丢失现象,培养细菌前最好先划线活化,以稳定产量;

(3) 细菌未充分裂解:细菌须在Buffer P1/RNase A 中充分重悬,成团的细菌因无法裂解会降低产量;

(4) 试剂准备有误:Buffer P2、Buffer E3有沉淀析出,需37℃水浴几分钟至清亮方可使用;Buffer PW加入乙醇体积不准确(使用前应按照试剂瓶标签的说明在Buffer PW中加入无水乙醇);

(5)将Endo-Free Buffer EB预热至65℃-70 ℃,并重复二次洗脱;

6)培养时间过长或在 2-8℃保存时间过长会明显降低产量,建议使用新鲜的菌液。

Q3:Buffer P2、BufferE3和BufferER有沉淀怎么办?
A3:

37℃水浴混匀至澄清后使用。

Q4:质粒 DNA 中有基因组 DNA 污染该如何解决?
A4:

加入Buffer P2后应温和混匀,不要剧烈震荡,以免打断基因组DNA。此

步骤所用时间应不超过5分钟,避免质粒受到破坏。

Q5:RNase A未加入Buffer P1会怎样?
A5:

导致RNA污染,需补加RNase ABuffer P1(终浓度160 μg/mL),混匀后2-8℃保存。

Q6:提取的质粒DNA下游实验结果不佳的原因? 
A6:

乙醇残留。Buffer PW 洗涤后应尽量离心去除残留的液体,待硅胶膜完全干燥后再加入洗脱缓冲液。

Q7:CW2113M 可以用来提取酵母质粒吗(将质粒转化到酵母感受态)?
A7:

不可以,因为酵母是真菌,细胞壁比大肠杆菌(细菌)的更厚,因此使用CW2113M更难裂解,建议使用Yeast Plasmid Mini KitCW0509S )提取。

Q8:试剂盒里面的 RNase A 和 Buffer P 1 混合后,说明书建议 2-8℃存放,放到室温2 天还可以用吗?
A8:

可以。最好按照标准存放。

Q9:产物有RNA残留的原因及解决办法?
A9:

(1)储存温度不当或超出有效期:已加入RNase A的Buffer P1长时间室温放置可能会出现酶活下降,使用后应及时放回2 ~ 8℃。

2)菌液体积过高:由于菌体数量过多,导致Buffer P1RNase A不足以消化菌体中的RNA,建议减少菌液体积进行实验。

Q10:能否使用GoldHi EndoFree Plasmid Maxi Kit(Plus)提取的DNA进行转染实验?
A10:

可以,该试剂盒提取的质粒纯度满足测序、PCR、酶切和转染等需求。

Q11:能否用水洗脱DNA? 
A11:

可以使用无菌无内毒素的核酸酶游离水(pH 7.0-8.5)从离心柱中洗脱DNA,以获得最佳洗脱效率。如需长期保存DNA,推荐使用试剂盒配套的DNA洗脱缓冲液。

Q12:使用GoldHi EndoFree Plasmid Maxi Kit(Plus) 时,为什么在琼脂糖凝胶上观察到质粒条带上方有拖尾现象? 
A12:

在质粒条带上方出现的拖尾现象可能表明质粒提取物中存在基因组DNA污染。虽然这种情况并不常见,但基因组DNA可能在裂解过程中被剪切并与质粒共同纯化。加入Buffer P2后剧烈摇晃或涡旋可能会产生断裂的基因组DNA,应避免这种情况。如果裂解液非常粘稠且混合不均匀,建议减少实验使用的细胞起始量。

Q13:使用GoldHi EndoFree Plasmid Maxi Kit(Plus)进行质粒提取后,哪些因素会影响提取产物的A260/280比值? 
A13:

A260/280比值通过比较核酸最大吸收峰260nm与蛋白质最大吸收峰280nm的吸光度值,可评估所洗脱DNA的相对纯度。若中和反应不充分或洗涤步骤不完全,可能导致过量蛋白质残留在基质中并与DNA共同洗脱。

Q14: 使用GoldHi EndoFree Plasmid Maxi Kit(Plus) 进行质粒提取后,哪些因素会影响提取产物的A260/230比值?
A14:

培养基成分和某些细胞成分会降低A260/A230比值。按照实验方案操作可确保去除这些污染物。此外,某些颗粒物可能与DNA一起洗脱,从而影响该比值。若出现这种情况,可在分光光度计(如Nanodrop®)检测前对洗脱的DNA进行额外15秒离心以沉淀颗粒物。

Q15: GoldHi EndoFree Plasmid Maxi Kit(Plus) 能否保证回收无内毒素的质粒DNA?
A15:

虽然Endo-Remover FQBuffer ER能去除样品中绝大部分内毒素,但无法保证回收的DNA完全不含内毒素。需要说明的是,我们已成功使用该试剂盒回收的质粒DNA转染多种耐受性强的细胞系。尽管其他供应商可能宣称其小提试剂盒"无内毒素",但通常仍可检测到微量内毒素存在。

Q16:Endo-Remover FQ过滤器堵塞怎么办?
A16:

避免倒入大块沉淀,缓慢推动推柄过滤。

Q17:如何保持离心管无内毒素污染? 
A17:

为确保实验材料无内毒素污染,建议遵循以下操作规范:首选经认证的无热原/内毒素一次性塑料耗材(市售多种品牌可选),避免使用玻璃器皿因其表面易吸附内毒素且常规清洗和高压灭菌均无法有效清除(若必须使用玻璃器皿,需180℃干热过夜处理)。特别注意曾接触细菌的灭菌锅会造成玻璃器皿二次污染。

Q18:内毒素残留高该如何解决?
A18:

可进行内毒素去除加强版的操作步骤。若Buffer ER出现沉淀,请于37℃加热至完全溶解并充分混匀后使用。加入ER缓冲液后需上下颠倒以确保充分混匀。

Q19:柱平衡的作用是什么?
A19:

柱平衡是通过Buffer PS预处理吸附柱,目的是激活硅基质膜,提高其对质粒DNA的结合效率,从而提升最终产物的纯度和得率。

Q20:CWBlue指示剂是否必须使用?
A20:

非必需,但建议添加以便监控裂解(变蓝色)和中和(无色+白色沉淀)效果。

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